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        【顯微課堂】高質(zhì)量超薄切片:自動對刀

        更新時間:2024-05-21      點擊次數(shù):531

        如何提高超薄切片機的切片質(zhì)量
        并實現(xiàn)自動對齊功能

        圖片

        超薄切片技術(shù)是獲取樣品切片的zui常用方法。在室溫條件制備時,將樣品小塊嵌入環(huán)氧樹脂中,然后通過修剪去除多余的樹脂,并使用玻璃刀或金剛石刀將樣品切成厚度為50-100納米之間的薄片。

        切片過程涉及多個手動制備步驟。在本應用說明中,我們將概述該過程,并解釋新的自動化解決方案,如何wanquan消除復雜的手動設(shè)置需求。


        簡 介




        透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)等電子顯微鏡技術(shù),廣泛應用于獲取生物或非生物材料樣品的結(jié)構(gòu)信息。在電子顯微鏡(EM)應用中,較厚的樣品被切割成厚度小于100納米的超薄切片。


        該樣品制備方法有助于獲取高分辨率的電子顯微鏡圖像,并且能夠進一步通過計算重建從多個連續(xù)切片中收集的信息,從而獲得較厚樣品的概覽(體積電子顯微鏡學)。




        樣品塊的修整



        為了獲得具有特定厚度的均勻切片,必須執(zhí)行多個手動步驟,并具備相應的技能和專業(yè)知識。



        粗 修


        在切割感興趣區(qū)域之前,必須對樣品進行初步修整,以露出目標點,并去除過量的無樣品聚合物或非目標樣品區(qū)域。通常,修整的結(jié)果是形成(堆疊的)金字塔形狀,其尺寸逐漸減?。▓D1)。

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        圖1:經(jīng)過粗修和精修后的樣品塊。放大圖顯示了聚合物塊前端上的樣品面。聚合物塊前端面使用銑削裝置,以45°的形狀進行修整。使用超薄 切片機和具有45°邊緣的切片刀對塊面進行修整,形成金字塔形狀。


        首先,粗修是通過手動使用刀片或使用EM RAPID來制備金字塔截體。EM RAPID的高速金剛石銑削頭,可以以特定角度朝向樣品,同時樣品在四輪中能夠進行90°旋轉(zhuǎn)(圖2)。

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        圖2:使用EM RAPID銑削裝置對樣品塊進行粗修。左:修整前的樣品塊。中:銑削第二個區(qū)域。右:最終粗修后的樣品。



        精 修


        接下來,將樣品塊安裝在超薄切片機上,并使用修塊刀小樣品區(qū)域并塑造其形狀,以形成最終的切面。精修的目的是將樣品感興趣區(qū)域包含在小于1平方毫米的矩形或梯形區(qū)域內(nèi),并使上下邊緣與切片刀wanquan平行(圖3),這將在后續(xù)步驟中允許切片彼此粘附形成帶狀。帶狀切片可以整體收集,使用戶能夠按照切片的順序進行拍攝,這對于陣列斷層掃描應用尤其重要。

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        圖3:使用金剛石修塊刀進行精修。左:粗修后的樣品塊。中:精修前樣品塊的前端。下方可見一把45°金剛石修塊刀。右:樣品塊面的前端和右側(cè)已經(jīng)進行了精修。




        樣品與切片刀之間對齊


        在對樣品塊進行修整以獲得平坦且暴露的塊面后,將其正確對齊到切片刀邊緣至關(guān)重要。最終目標是使樣品與切割平面之間的距離盡可能小,以避免樣品材料損失和切片不完整。


        wanmei對齊樣品和切片刀是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。它需要精密地手動調(diào)整樣品傾斜、旋轉(zhuǎn)和切片刀角度,同時需要正確地控制樣品進給(進刀)。


        這對于新手或不常使用超薄切片機的用戶來說尤其困難。不僅存在損壞昂貴切片刀的風險,而且還可能損壞樣品,無法用于切片。即使經(jīng)驗豐富的操作人員也需要小心謹慎,以確保在較薄樣品(如細胞單層)切片過程中,不會因初始位置未對齊,而損失太多材料。




        方 法

        為了判斷切片刀與樣品之間的距離,用戶需要使用底照光來觀察它們之間的間隙,整個過程在體視顯微鏡下進行。底照光從下方照亮切片刀的背面,并通過樣品塊面的光滑表面反射光線,呈現(xiàn)為一條明亮的條紋(圖4)。這被稱為“光隙"。


        wanmei對齊表現(xiàn)為在整個塊面長度上均勻?qū)挾鹊谋。ㄋ{色)光隙(見下文)。


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        圖4:切片刀背面在樣品塊面上的反射圖像。左:概覽圖,底照光被切片刀的背面反射至樣品塊面,幾乎照亮了整個前端面。右:用切片刀接近樣品時,塊面上的反射光變成小條紋,稱為光隙。光隙是指示切片刀與塊面之間方向的工具。

        以下步驟通常以迭代順序執(zhí)行,直到塊面和切片刀對齊為止。通常,兩者之間的距離可以小于500納米。



        樣品旋轉(zhuǎn)


        為確保切片能夠彼此粘附并形成帶狀,切片的上下邊緣必須wanquan平行。這只有在整個塊面與切片刀wanquan接觸時才能實現(xiàn)。因此,必須旋轉(zhuǎn)樣品以使其與切片刀邊緣平行(圖5)。

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        圖5:調(diào)整樣品旋轉(zhuǎn)。左:樣品旋轉(zhuǎn)與切片刀邊緣的示意圖。中:樣品未正確旋轉(zhuǎn)。右:樣品正確對齊到切片刀。

        首先,將切片刀座移至足夠接近樣品的位置,以產(chǎn)生光隙。一旦在塊面上觀察到光隙,用戶需要調(diào)整樣品旋轉(zhuǎn),使塊面下邊緣與切片刀平行。如果未調(diào)整切片刀角度,可能無法使樣品和切片刀平行,因為塊面尚未被修塊刀修整。



        切片刀角度


        為了補償塊面表面與切片刀之間的角度,需要旋轉(zhuǎn)切片刀,直到塊面的前導邊緣與切片刀平行(圖6)。這將確保樣品從左到右的整個區(qū)域與切片刀接觸,從而提供完整的切片,不會損失太多樣品材料。此外,上述操作確保樣品切割均勻,并使切片能夠彼此粘附,在切片刀水槽中形成條帶(圖6,下圖)。

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        圖6:調(diào)整切片刀角度。左上:切片刀和樣品塊面的示意圖。藍色切片刀以其邊緣與塊面平行的方式轉(zhuǎn)動。中上圖像:底照光照亮的塊面圖像。切片刀邊緣在圖像底部可見為黑色條紋。切片刀邊緣必須與塊面的下邊緣平行,但在這里并非如此。右上圖像:調(diào)整切片刀角度,使其與塊面邊緣平行。下圖像:切片在切片刀水槽中形成條帶。切片具有wanquan平行的邊緣,因此彼此粘附。



        樣品傾轉(zhuǎn)

        樣品傾轉(zhuǎn)是最關(guān)鍵但不易觀察的影響參數(shù)之一。如果樣品傾轉(zhuǎn)不正確,切片刀在切割過程中將不會與樣品運動保持一致。因此,在獲得完整切片之前,可能會丟失珍貴的樣品。


        通過弧形樣品夾以調(diào)整塊面與切片刀邊緣之間的角度,可以調(diào)節(jié)樣品傾轉(zhuǎn)。以光隙為指標,用戶在調(diào)整過程中需要上下移動樣品,直到光隙在整個塊面上顯示相同的厚度(圖7)。


        這需要通過迭代方法來調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)。在這個階段,切勿將切片刀太靠近樣品,否則塊面的離切片刀較近部分可能會被wanquan切掉,從而有損失整個樣品的風險。同時,也存在切片刀損壞的風險。

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        圖7:調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)。左:樣品傾轉(zhuǎn)原理的示意圖。樣品傾轉(zhuǎn),直到塊面表面沿切割運動方向與切片刀邊緣對齊。中:上下移動樣品時的兩個光隙圖像?;疑珬l紋的厚度不同。右:調(diào)整后的光隙。



        以光隙為作為調(diào)整的指標


        樣品和切片刀角度調(diào)整的最后一步是使用光隙作為指標進行調(diào)整。在調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)之后,小心地將切片刀朝樣品推進,直到切片刀與塊面之間的光隙幾乎看不見。在接近過程中,光隙的顏色會發(fā)生變化,直到最終變?yōu)樗{色(顏色的變化是衍射的結(jié)果,圖8)。使用這種方法,在整個塊面上對齊偏差能夠小于1µm。從塊面反射出的藍色光隙,通常表示塊面與切片刀之間的距離約為400納米。在此距離下,在所有角度上均勻分布的光隙是zui精確指標,盡可能減小材料的損失。

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        圖8:精細調(diào)整過程中,切片刀與塊面之間衍射產(chǎn)生的藍色光隙。


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        圖9:帶有電動切片刀架(1)和弧形樣品夾(2)的UC Enuity

        內(nèi)置的flexacam(i5或c5)相機,提供了切片刀和光隙的圖像,這些圖像會被分析,并將信息發(fā)送回來,以進行自動對齊工作(圖10)。


        圖片

        圖10:內(nèi)置flexacam i5相機和觸摸屏截圖,顯示帶有自動對齊反饋線的圖像(也見下文)。


        對齊過程會引導用戶完成接近階段,最終對齊步驟將自動完成。這種自動化設(shè)計旨在保護切片刀和塊面免受損壞,同時幫助用戶實現(xiàn)wanmei對齊。該功能幫助未經(jīng)過培訓的用戶,如在核心設(shè)施或研究組內(nèi)工作的用戶,在切片刀和樣品的初始定位階段,在不承擔損壞風險的情況下獲得高質(zhì)量切片。


        需要注意的是,要執(zhí)行wanquan自動對齊功能,必須滿足某些先決條件。例如,塊面尺寸必須至少為250 x 250µm,最大為1200 x 1200µm。此外,塊面必須具有反射性且足夠干凈。




        自動化工作流程


        開始自動對齊程序前,首先應將切片刀接近塊面并居中。在用戶確認后,將執(zhí)行自動對齊功能(圖11)。

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        圖11:UC Enuity顯示屏截圖,顯示檢測光隙步驟中的相關(guān)交互按鈕(左)。自動對齊過程中的相機圖像(右)。反饋線指示圖像中是否檢測到正確的邊緣。綠色:垂直中心線;洋紅色:光隙的上邊緣;白色:光隙的下邊緣(此處不可見,與紅線重合);紅色:切片刀邊緣;藍色:自動檢測到的塊面左邊緣和右邊緣。


        軟件檢測圖像中的不同邊緣,并對切片刀角度、樣品傾斜和樣品旋轉(zhuǎn)進行迭代對齊。在此過程中,樣品會上下?lián)u動,以觀察分析整個塊面范圍的光隙,并據(jù)此調(diào)整樣品傾斜


        在過程結(jié)束時,可以自動將切片刀接近樣品,直到大約5µm的距離(圖12)。如果需要,也可以進行手動校正。


        圖片

        圖12:切片刀接近樣品,安全距離約為5µm。左:對齊后,用戶可以決定自動或手動接近樣品。右:接近后的光隙。將保持約5µm的安全距離。



        多組測試結(jié)果

        對齊過程的目的是避免在獲得完整切片之前,不必要地損失部分樣品區(qū)域。為了提供確鑿的證據(jù),證明自動對齊功能能夠可靠地產(chǎn)生高質(zhì)量切片,我們對樣品進行了一系列超薄切片測試。


        在第一組代表性樣品中,專家手動進行了對齊。通常,專家需要切割5-10個厚度為100nm的部分切片,直到獲得完整切片。另一組樣品使用UC Enuity的自動對齊功能進行修塊,其中五個不同樣品使用不同設(shè)備進行修塊,樣品塊面尺寸不同。在兩組測試中,部分切片的平均數(shù)量均低于或等于10,而最少部分切片的數(shù)量在3到7之間(表2)。這證明使用UC Enuity可以成功實現(xiàn)自動對齊。


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        表2:使用UC Enuity自動對齊后獲得完整切片所需的部分切片數(shù)量。

        測試1,n=4;測試2,n=2;測試3,n=4;測試4,n=7;測試5,n=2。



        總 結(jié)

        在超薄切片中,切片刀和樣品的對齊,對于實現(xiàn)高質(zhì)量切片和減少獲得完整切片前的樣品材料損失至關(guān)重要。


        由于對齊過程較為復雜,手動操作時需要用戶具備豐富經(jīng)驗,因此UC Enuity提供的自動對齊解決方案,有助于減少非熟練和不常用戶對樣品或切片刀造成損壞的風險。UC Enuity還幫助他們實現(xiàn)wanmei的光隙調(diào)整,為高質(zhì)量的切片提供了基礎(chǔ)。



        相關(guān)產(chǎn)品


        圖片

        UC Enuity 超薄切片機


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