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整個(gè)小鼠胚胎的圖像：（左）原始寬場(chǎng)成像結(jié)果和（右）應(yīng)用Large Volume Computational Clearing（LVCC）后的成像結(jié)果。圖片來(lái)源：A. Popratiloff和Z. Motahari，美國(guó)喬治·華盛頓大學(xué)。
本文介紹了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）對(duì)小鼠胚胎快速、高對(duì)比度成像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)軸突生長(zhǎng)和腦神經(jīng)發(fā)育的研究。許多在發(fā)育早期階段損害神經(jīng)回路發(fā)育的遺傳性疾病被認(rèn)為會(huì)對(duì)行為造成干擾。用小鼠模型研究早期神經(jīng)發(fā)育的細(xì)胞變化、定義與人類(lèi)疾病相似的行為及潛在發(fā)育機(jī)制，是非常困難的。而鑒別發(fā)育的神經(jīng)元回路中三叉神經(jīng)（其參與面部感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)機(jī)能）軸突生長(zhǎng)的早期分化，使得這些困難迎刃而解。
人們普遍認(rèn)為，很多遺傳性疾病都通過(guò)損害神經(jīng)回路發(fā)育的早期階段來(lái)對(duì)行為產(chǎn)生干擾[1]。事實(shí)證明，在模型動(dòng)物中分辨早期神經(jīng)發(fā)育中細(xì)胞的此類(lèi)變化具有一定的難度。用與人類(lèi)遺傳性疾病中臨床顯著缺陷相似的基因突變小鼠模型來(lái)定義行為、神經(jīng)回路和潛在發(fā)育機(jī)制，是非常困難的[1]。檢測(cè)單個(gè)神經(jīng)元初始分化中的變化難以實(shí)現(xiàn)。這些挑戰(zhàn)可通過(guò)確定發(fā)育的神經(jīng)回路中三叉神經(jīng)這一關(guān)鍵組分的軸突生長(zhǎng)的早期分化來(lái)解決[1]。通過(guò)著眼于參與面部感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)機(jī)能如哺乳、進(jìn)食、咬、咀嚼和吞咽等的三叉神經(jīng)（腦神經(jīng)V），以及軸突生長(zhǎng)和原生傳導(dǎo)通路，可以對(duì)使用組織學(xué)處理可能會(huì)缺失的三維環(huán)境進(jìn)行研究[1]。本文介紹如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]對(duì)小鼠胚胎快速、高對(duì)比度成像，以幫助進(jìn)行腦神經(jīng)發(fā)育研究。
如要以實(shí)用高效的方式對(duì)整個(gè)小鼠胚胎成像，快速、清晰的高對(duì)比度3D成像解決方案，對(duì)于重要細(xì)節(jié)展示和解析大有益處。相較于激光共聚焦成像，可在很短的時(shí)間內(nèi)一次性采集到完整胚胎的成像結(jié)果。傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微成像速度快，檢測(cè)靈敏度高，但是對(duì)厚標(biāo)本的成像，如小鼠胚胎，通常會(huì)由于非焦平面信號(hào)的影響，呈現(xiàn)模糊的成像結(jié)果，降低圖像對(duì)比度[2,3]。
使用THUNDER Imager 3D Cell Culture對(duì)小鼠胚胎成像。使用抗βIII微管蛋白（Tuj1）抗體對(duì)胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)和腦神經(jīng)進(jìn)行染色。結(jié)合BABB透明化處理，即可對(duì)整個(gè)胚胎中的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)成像。圖1中的圖像使用數(shù)值孔徑（NA）0.75、工作距離700μm的20x多浸液物鏡采集。該圖像由32個(gè)視野拼接組成，成像深度為672 μm（337層切），采集了完整的胚胎結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)采集總時(shí)長(zhǎng)為18分鐘。
通過(guò)LVCC和Instant Computational Clearing（ICC）將寬場(chǎng)成像固有的非焦面模糊信號(hào)清除[2,3]。之后，再使用徠卡自適應(yīng)式反卷積技術(shù)來(lái)增強(qiáng)三維特征結(jié)構(gòu)的分辨率[4]。這種成像模式便于觀察胚胎的神經(jīng)結(jié)構(gòu)以及胚胎的整體布局中更有價(jià)值的神經(jīng)元定位。
圖1：展示整個(gè)小鼠胚胎的俯視圖，顯示原始數(shù)據(jù)（A）與應(yīng)用LVCC后（B）的差異。根據(jù)相對(duì)物鏡深度進(jìn)行顏色標(biāo)識(shí)的胚胎的角度視圖，其中最大深度為672 μm。C）應(yīng)用LVCC后的腦部側(cè)視圖，顯示了沿Z軸方向的精密細(xì)節(jié)。圖片來(lái)源：Anastas Popratiloff博士和Zahra Motahari博士，喬治·華盛頓大學(xué)納米制造與成像中心（GWNIC），美國(guó)華盛頓特區(qū)。
結(jié)論
與傳統(tǒng)的寬場(chǎng)成像不同，THUNDER技術(shù)Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]在對(duì)小鼠胚胎中的腦神經(jīng)發(fā)育成像時(shí)，顯著增強(qiáng)了圖像對(duì)比度，對(duì)精密細(xì)節(jié)有更好的解析。
References：
1.Z. Motahari, T.M. Maynard, A. Popratiloff, S.A. Moody, A.-S. LaMantia, Aberrant early growth of individual trigeminal sensory and motor axons in a series of mouse genetic models of 22q11.2 deletion syndrome, Human Molecular Genetics (2020) vol. 29, iss. 18, pp. 3081-3093, DOI: 10.1093/hmg/ddaa199.
2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.
4.V. Kohli, J.M. Marr, O. Schlicker, L. Felts, The Power of Pairing Adaptive Deconvolution with Computational Clearing: Technical Brief, Science Lab (2021) Leica Microsystems.
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