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        【THUNDER小課堂】視網(wǎng)膜相互作用的可視化助力眼部疾病的研究

        更新時(shí)間:2023-03-21      點(diǎn)擊次數(shù):1427

        對(duì)小鼠整個(gè)視網(wǎng)膜進(jìn)行快速、清晰的高對(duì)比度成像,以研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。


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        本文描述通過使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing(LVCC)技術(shù)高效地研究小鼠視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。視網(wǎng)膜血管疾病一般是視力受損的主要原因?;蛲蛔儠?huì)導(dǎo)致人體視網(wǎng)膜血管發(fā)生改變,進(jìn)而引發(fā)家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(FEVR)、諾里病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)或Coats病。


        視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用可使用小鼠視網(wǎng)膜模型來進(jìn)行研究。通過整個(gè)視網(wǎng)膜制樣和高分辨率熒光成像可觀察視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞相互作用的信息。


        簡(jiǎn)介

        視網(wǎng)膜血管疾病是導(dǎo)致視力受損和失明的主因[1]。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜由三層血管網(wǎng)絡(luò)形成,其中包括兩個(gè)視網(wǎng)膜內(nèi)毛細(xì)血管床。在人體內(nèi),基因突變會(huì)引發(fā)家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(FEVR)、以及周邊視網(wǎng)膜血管化不完整為特征的遺傳性疾病、如諾里病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)或Coats病[1]?;加羞@些疾病的視網(wǎng)膜血管都有所改變??茖W(xué)家利用小鼠視網(wǎng)膜模型來研究視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞間的相互作用。利用整個(gè)視網(wǎng)膜制片來展示視網(wǎng)膜血管[1]。固定并染色后,必須對(duì)整個(gè)視網(wǎng)膜進(jìn)行高分辨率成像,以觀察整個(gè)血管網(wǎng)絡(luò)及單細(xì)胞相互作用。本文將展示如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing(LVCC)高效地研究小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞間的相互作用[2,3]。


        挑戰(zhàn)

        如何對(duì)整個(gè)視網(wǎng)膜進(jìn)行快速成像,并獲得清晰的高對(duì)比度3D成像結(jié)果,展示重要細(xì)節(jié)對(duì)研究視網(wǎng)膜至關(guān)重要。視網(wǎng)膜成像一般使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描,但是這種方法要花費(fèi)數(shù)小時(shí)才能采集到整個(gè)視網(wǎng)膜圖像。而常規(guī)的寬場(chǎng)顯微雖然成像速度快,檢測(cè)靈敏度高,但是對(duì)厚標(biāo)本的成像,如整個(gè)視網(wǎng)膜,通常會(huì)出現(xiàn)非焦平面干擾導(dǎo)致模糊,降低對(duì)比度[2,3]。


        方法

        使用THUNDER Imager 3D Cell Culture儀器對(duì)整個(gè)視網(wǎng)膜進(jìn)行成像。使用抗CD31抗體標(biāo)記視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(黃色),使用IsoB4標(biāo)記視網(wǎng)膜血管和小膠質(zhì)細(xì)胞(品紅色),并使用抗GFAP抗體標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞(青色)。觀察整個(gè)視網(wǎng)膜時(shí),采用3個(gè)熒光通道,用20x Plan Apo 0.8 NA(數(shù)值孔徑)物鏡和100個(gè)視野拼接、厚度為15-μm進(jìn)行 Z軸堆棧成像。


        結(jié)果

        Large Volume Computational Clearing(LVCC)[2,3]方法可清晰展示視網(wǎng)膜內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞間的相互作用(見圖1)。一般情況下,通過寬場(chǎng)顯微鏡很難觀察到視網(wǎng)膜中的這些細(xì)胞。通過THUNDER Imager 3D Cell Culture進(jìn)行高速采集,可在幾分鐘時(shí)間內(nèi)采集到大約24 GB的整個(gè)視網(wǎng)膜成像。采用LAS X Navigator軟件中焦平面矯正的方法,可以保證視網(wǎng)膜樣本每一個(gè)位置都處于最佳焦平面。

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        圖1:使用THUNDER Imager 3D Cell Culture整個(gè)視網(wǎng)膜制片的zui大化投影圖像:A) 寬場(chǎng)原始數(shù)據(jù)和 B) LVCC結(jié)果。插圖所示為單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞(黃色, CD31抗體)、血管和小膠質(zhì)細(xì)胞(品紅色,IsoB4)和星形細(xì)胞(青色, GFAP抗體)的寬場(chǎng)視圖。圖片來源:Jiyeon Lee博士和Jeremy Burton博士,Roche Genentech,美國(guó)加利福尼亞州南舊金山。


        結(jié)論

        THUNDER Large Volume Computational Clearing(LVCC)[2,3]與傳統(tǒng)寬場(chǎng)成像相比,對(duì)整個(gè)小鼠視網(wǎng)膜成像時(shí)會(huì)顯著增強(qiáng)對(duì)比度,可以高效地研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞間的相互作用。


        References:


        1.H.J. Junge, S. Yang, J.B. Burton, K. Paes, X. Shu, D.M. French, M. Costa, D.S. Rice, W. Ye, TSPAN12 Regulates Retinal Vascular Development by Promoting Norrin- but Not Wnt-Induced FZD4/β-Catenin Signaling, Cell (2009) vol. 139, iss. 2, pp. 299-311, DOI: 10.1016/j.cell.2009.07.048.

        2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.

        3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.



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