趙夢路
分離的人類胰島的三維重建:綠色的胰島素(AF488)，紅色的胰高血糖素(AF555)，洋紅色的IL-17 (AF647)和藍(lán)色的細(xì)胞核（Hoechst）Courtesy Prof. Von Herrath, San Diego, CA (USA)
細(xì)胞是生命的基本單位，細(xì)胞生物學(xué)是研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科。細(xì)胞生物學(xué)研究熱點主要聚焦在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號通路、細(xì)胞器功能和結(jié)構(gòu)解析、能量代謝和表觀遺傳等方面，細(xì)胞生物學(xué)研究難點在于細(xì)胞是非常精密且微小的單位，而觀察設(shè)備存在空間、時間以及分辨率上的限制。
隨著顯微鏡和染色技術(shù)的改進(jìn)，科學(xué)家們能夠看到越來越多的細(xì)胞內(nèi)部細(xì)節(jié)。范·列文虎克使用的顯微鏡可能把標(biāo)本放大了幾百倍。今天，高分辨率熒光顯微鏡可以在微米及以下范圍觀察細(xì)胞器的形狀，借助活細(xì)胞工作站可以將細(xì)胞的生命活動完整記錄下來；通過激光掃描共聚焦顯微鏡，可以對細(xì)胞進(jìn)行三維光學(xué)切片成像，使研究人員能夠生成細(xì)胞的詳細(xì)三維圖像；利用STED納米顯微鏡可以探究細(xì)胞器內(nèi)部結(jié)構(gòu)、離子通道的亞基甚至分子水平的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息……想要充分?jǐn)U展自己的研究成果并獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，選擇合適的顯微成像方法至關(guān)重要。
細(xì)胞生物學(xué)研究痛點
細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)解析解決
STED是基于STELLARIS共聚焦平臺純光學(xué)超高分辨技術(shù)，結(jié)合快速熒光壽命采集系統(tǒng)實現(xiàn)XY軸30nm分辨率極限。同時運用FLIM Phasor技術(shù)可顯著降低STED激光能量，適用于活細(xì)胞超高成像。TauSTED特別適合應(yīng)用于組織和細(xì)胞內(nèi)微小結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的觀察，如膜蛋白與膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞器內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元突觸研究、細(xì)菌內(nèi)部的物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究、病毒學(xué)研究、蛋白復(fù)合物研究等等。
借助STED技術(shù)揭示核孔復(fù)合物結(jié)構(gòu)
STED揭示不同狀態(tài)下線粒體膜融合過程
TIRF（全內(nèi)反射熒光顯微鏡）主要應(yīng)用方向：細(xì)胞膜成像、囊泡運輸、單分子示蹤、受體動力學(xué)變化/聚集、受體超分辨成像、體外蛋白研究、細(xì)胞骨架組裝、胞吞胞吐、細(xì)胞粘附、細(xì)胞運動。
Hela細(xì)胞，使用Dil標(biāo)記細(xì)胞膜（左圖普通熒光顯微鏡，右圖TIRF膜成像）
STELLARIS FALCON是Leica最新的集成整合方案，將FLIM結(jié)合到STELLARIS共聚焦平臺，實現(xiàn)快速FLIM數(shù)據(jù)采集。
目前，F(xiàn)LIM技術(shù)越來越多的應(yīng)用到生物學(xué)研究中，常見的應(yīng)用有測定分子相互作用FLIM-FRET，環(huán)境感知和組分分離等，在活細(xì)胞中典型應(yīng)用就是利用FLIM-FRET研究活細(xì)胞分子相互作用。
排除熒光漂白和淬滅對FRET測定的影響，精準(zhǔn)測量分子間相互作用強度。無需考慮acceptor熒光，實驗簡單?？蛇M(jìn)行離體活細(xì)胞和在體活細(xì)胞快速FLIM-FRET測量。
FLIM研究活細(xì)胞代謝
Fast FLIM image and FLIM phasor plot of U2OS cells labeled with Flipper TR, left cell in cell culture medium, right cell treated with 5% concentration glucose
活細(xì)胞解決快速成像
細(xì)胞是組成生命個體的基本單位，實時在線研究細(xì)胞的增殖、代謝、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)，有助于了解細(xì)胞的生命規(guī)律，通過現(xiàn)象揭示生命本質(zhì)。
THUNDER高分辨活細(xì)胞解決方案
C2C12細(xì)胞生長和遷移到雙方transwell膜沾核纖層蛋白B(紅色)核結(jié)構(gòu),赫斯特(藍(lán)色)的DNA,和γH2AX DNA損傷(黃色)。細(xì)胞成像使用THUNDER活細(xì)胞培養(yǎng)成像系統(tǒng)與63X/1.4油浸物鏡。圖片上面代表擴展景深預(yù)測厚17.47µm z-stacks。圖片由美國加州大學(xué)戴維斯分校生物科學(xué)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)和行為系盧卡斯·史密斯博士提供。
STELLARIS Lightning
細(xì)胞生物學(xué)研究已經(jīng)不再局限于細(xì)胞層面觀察，而是聚焦于亞細(xì)胞器、染色體、離子通道等細(xì)小結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡雖然有成像速度快、光毒性低的有點，但是空間分辨率并不能滿足對亞細(xì)胞器更精細(xì)結(jié)構(gòu)解析的分辨率需求。Leica STELLARIS Lightning超分辨系統(tǒng)基于共聚焦平臺，XY分辨率達(dá)到120nm，Z方向達(dá)到了200nm，超越了普通共聚焦光學(xué)極限。
Gatta Cell，細(xì)胞核-DAPI，線粒體-Tom20 Alexa488，Actin-Alexa555，Tubulin-Alexa635
Lightning超分辨成像
STELLARIS的每個檢測器都是光譜式檢測器，可以實現(xiàn)410nm-850nm光譜檢測，配備485-685nm或440-790nm白激光，譜線任意可調(diào)，滿足染料最佳激發(fā)譜線需求。白激光和HyD檢測器實現(xiàn)激發(fā)和發(fā)射光譜檢測自由。STELLARIS共聚焦平臺使用棱鏡分光和狹縫檢測，在任意波長都可以有非常高的分光效率，利用熒光信號。
STELLARIS多色成像
NE-115 cells. LifeAct-mNeonGreen (left: yellow, right: red), MitoTracker Green (left: yellow, right: green), NUC Red (left: gray, right: blue), and SiR-tubulin (left: gray, right: magenta)?.Courtesy: Max Heydasch, University of Bern and Spirochrome
TauSense時間分辨共聚焦成像系統(tǒng)
NE-115細(xì)胞同時標(biāo)記了actin-mNeonGreen、Mitotracker Green、細(xì)胞核Red和SiR-tubulin共4種熒光染料，但由于LifeAct-mNeonGreen和Mitotracker Green的發(fā)射光譜高度重疊，NuC Red和SiR-tubulin的發(fā)射光譜高度重疊，所以在用常規(guī)共聚焦（左圖）拍攝時只能體現(xiàn)出兩種信號的差異。而在TauSeparation模式下（右圖），基于平均光子到達(dá)時間AAT，我們使用一個檢測器就可以同時將這兩種發(fā)射光譜重疊的染料區(qū)分出來（LifeAct-mNeonGreen-紅色，Mitotracker Green-綠色，Nuc Red–青色，SiR-tubulin–品紅色），所以只需要使用兩個檢測器，就可以得到這幅沒有串色的4色熒光圖像了。
活體動物、類器官水平
STELLARIS DIVE光譜式多光子顯微成像系統(tǒng)
4Tune – the world’s first and only spectral NDD
Blue: Astrocytes, Sulforhodamine;Green: Microglia, GFP;Yellow: Neurons, YFP;Red: Blood, Alexa680-Dextran 活體小鼠在體腦細(xì)胞多色成像
多光子FLIM在活體細(xì)胞水平研究藥物靶向作用機理
用FLIM-FRET研究藥物對胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的靶向作用，實現(xiàn)了對腫瘤不同微區(qū)的單細(xì)胞反應(yīng)的觀察。
Conway JRW, et al. Cell Rep. 2018 Jun 12;23(11):3312-3326.
Intravital Imaging to Monitor Therapeutic Response in Moving Hypoxic Regions Resistant to PI3K Pathway Targeting in Pancreatic Cancer
STELLARIS DLS光片成像
Leica STELLARIS共聚焦平臺可以無縫升級light sheet功能，升級后一套儀器同時擁有完整的共聚焦和光片的功能。Leica DLS數(shù)字光片技術(shù)可快速實現(xiàn)雙側(cè)照明，具有光毒性低，成像速度快，適合3D成像的優(yōu)點。DLS和雙光子共聚焦搭配，可以實現(xiàn)定點損傷和快速光片成像相結(jié)合。
Movie courtesy of B. Eismann/C. Conrad at BioQuant/DKFZ Heidelberg 3D培養(yǎng)細(xì)胞光片成像
細(xì)胞操作
- Leica DMi8 Infinity Scanner
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Hela Cells expression paGFP-H2B (histone marker). Courtesy Rebecca Smith, LMU, Munich.
Leica Infinity Scanner實現(xiàn)快速：
- 激光切割、消融、解籠鎖、DNA損傷
- 光激活、光開關(guān)、漂白、光遺傳
- FRET受體漂白法等光學(xué)刺激實驗
Leica DMi8 Infinity PLU脈沖激光模塊
Infinity PLU應(yīng)用：
- 活細(xì)胞切割
- 活細(xì)胞和細(xì)胞器消融
- DNA損傷
MDCK cells, cutting;Sample Courtesy: Prof. Dr. Ralf Jacob, Marburg, Germany
激光顯微切割精準(zhǔn)取材
Leica激光顯微切割優(yōu)勢
- 正置鏡平臺，適合病理切片和活細(xì)胞樣本切割；
- 明場和熒光實時切割，操作簡單快速；
- 紫外激光切割，直接汽化，切緣平整不損傷生物大分子；
- 激光束移動切割，切割精度可達(dá)0.07μm；
- 重力收集，簡單高效，收集耗材成本低，實用高通量切割工具
單細(xì)胞克隆制備
THUNDER Imager EM Cryo CLEM冷凍光電聯(lián)用助力細(xì)胞超精細(xì)結(jié)構(gòu)解析
傳統(tǒng)光電聯(lián)用受限于光鏡分辨率，熒光數(shù)據(jù)在電鏡下目標(biāo)不明確，THUNDER Cryo-CLEM是冷凍光電聯(lián)用專用設(shè)備，具有分辨率高可以精準(zhǔn)識別細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在相關(guān)工作流程中平穩(wěn)、安全傳送坐標(biāo)、圖像和樣本。
冷凍光電聯(lián)用實驗流程Cryo-CLEM / Cryo-ET
徠卡冷凍光電聯(lián)用優(yōu)勢：
- 冷凍光鏡專用傳輸桿，更換樣品方便
- 傳輸桿液氮控溫，確保樣品安全轉(zhuǎn)移
- 有普通載網(wǎng)夾具和Auto grid夾具
- 該流程中所有附件均由徠卡提供，避免第三方紛爭
長按識別二維碼，觀看直播視頻，一起探秘細(xì)胞究竟
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