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        徠卡課堂|細(xì)胞探秘之旅——多維度解析細(xì)胞生命活動

        更新時間:2021-06-16      點擊次數(shù):1412

        趙夢路



        分離的人類胰島的三維重建:綠色的胰島素(AF488),紅色的胰高血糖素(AF555),洋紅色的IL-17 (AF647)和藍(lán)色的細(xì)胞核(Hoechst)Courtesy Prof. Von Herrath, San Diego, CA (USA)

        細(xì)胞是生命的基本單位,細(xì)胞生物學(xué)是研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科。細(xì)胞生物學(xué)研究熱點主要聚焦在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號通路、細(xì)胞器功能和結(jié)構(gòu)解析、能量代謝和表觀遺傳等方面,細(xì)胞生物學(xué)研究難點在于細(xì)胞是非常精密且微小的單位,而觀察設(shè)備存在空間、時間以及分辨率上的限制。

        隨著顯微鏡和染色技術(shù)的改進(jìn),科學(xué)家們能夠看到越來越多的細(xì)胞內(nèi)部細(xì)節(jié)。范·列文虎克使用的顯微鏡可能把標(biāo)本放大了幾百倍。今天,高分辨率熒光顯微鏡可以在微米及以下范圍觀察細(xì)胞器的形狀,借助活細(xì)胞工作站可以將細(xì)胞的生命活動完整記錄下來;通過激光掃描共聚焦顯微鏡,可以對細(xì)胞進(jìn)行三維光學(xué)切片成像,使研究人員能夠生成細(xì)胞的詳細(xì)三維圖像;利用STED納米顯微鏡可以探究細(xì)胞器內(nèi)部結(jié)構(gòu)、離子通道的亞基甚至分子水平的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息……想要充分?jǐn)U展自己的研究成果并獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù),選擇合適的顯微成像方法至關(guān)重要。

        細(xì)胞生物學(xué)研究痛點


        細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)解析解決
        • STED納米顯微成像技術(shù)

        STED是基于STELLARIS共聚焦平臺純光學(xué)超高分辨技術(shù),結(jié)合快速熒光壽命采集系統(tǒng)實現(xiàn)XY軸30nm分辨率極限。同時運用FLIM Phasor技術(shù)可顯著降低STED激光能量,適用于活細(xì)胞超高成像。TauSTED特別適合應(yīng)用于組織和細(xì)胞內(nèi)微小結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的觀察,如膜蛋白與膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞器內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元突觸研究、細(xì)菌內(nèi)部的物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究、病毒學(xué)研究、蛋白復(fù)合物研究等等。


        借助STED技術(shù)揭示核孔復(fù)合物結(jié)構(gòu)
         
         
        STED揭示不同狀態(tài)下線粒體膜融合過程
         

        TIRF(全內(nèi)反射熒光顯微鏡)主要應(yīng)用方向:細(xì)胞膜成像、囊泡運輸、單分子示蹤、受體動力學(xué)變化/聚集、受體超分辨成像、體外蛋白研究、細(xì)胞骨架組裝、胞吞胞吐、細(xì)胞粘附、細(xì)胞運動。


        Hela細(xì)胞,使用Dil標(biāo)記細(xì)胞膜(左圖普通熒光顯微鏡,右圖TIRF膜成像)
         

        STELLARIS FALCON是Leica最新的集成整合方案,將FLIM結(jié)合到STELLARIS共聚焦平臺,實現(xiàn)快速FLIM數(shù)據(jù)采集。

        目前,F(xiàn)LIM技術(shù)越來越多的應(yīng)用到生物學(xué)研究中,常見的應(yīng)用有測定分子相互作用FLIM-FRET,環(huán)境感知和組分分離等,在活細(xì)胞中典型應(yīng)用就是利用FLIM-FRET研究活細(xì)胞分子相互作用。

        排除熒光漂白和淬滅對FRET測定的影響,精準(zhǔn)測量分子間相互作用強度。無需考慮acceptor熒光,實驗簡單??蛇M(jìn)行離體活細(xì)胞和在體活細(xì)胞快速FLIM-FRET測量。


        FLIM研究活細(xì)胞代謝


        Fast FLIM image and FLIM phasor plot of U2OS cells labeled with Flipper TR, left cell in cell culture medium, right cell treated with 5% concentration glucose

        活細(xì)胞解決快速成像

        細(xì)胞是組成生命個體的基本單位,實時在線研究細(xì)胞的增殖、代謝、凋亡和應(yīng)激反應(yīng),有助于了解細(xì)胞的生命規(guī)律,通過現(xiàn)象揭示生命本質(zhì)。

        THUNDER高分辨活細(xì)胞解決方案


        C2C12細(xì)胞生長和遷移到雙方transwell膜沾核纖層蛋白B(紅色)核結(jié)構(gòu),赫斯特(藍(lán)色)的DNA,和γH2AX DNA損傷(黃色)。細(xì)胞成像使用THUNDER活細(xì)胞培養(yǎng)成像系統(tǒng)與63X/1.4油浸物鏡。圖片上面代表擴展景深預(yù)測厚17.47µm z-stacks。圖片由美國加州大學(xué)戴維斯分校生物科學(xué)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)和行為系盧卡斯·史密斯博士提供。

        STELLARIS Lightning

        細(xì)胞生物學(xué)研究已經(jīng)不再局限于細(xì)胞層面觀察,而是聚焦于亞細(xì)胞器、染色體、離子通道等細(xì)小結(jié)構(gòu),傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡雖然有成像速度快、光毒性低的有點,但是空間分辨率并不能滿足對亞細(xì)胞器更精細(xì)結(jié)構(gòu)解析的分辨率需求。Leica STELLARIS Lightning超分辨系統(tǒng)基于共聚焦平臺,XY分辨率達(dá)到120nm,Z方向達(dá)到了200nm,超越了普通共聚焦光學(xué)極限。


        Gatta Cell,細(xì)胞核-DAPI,線粒體-Tom20 Alexa488,Actin-Alexa555,Tubulin-Alexa635
        Lightning超分辨成像
         
        STELLARIS的每個檢測器都是光譜式檢測器,可以實現(xiàn)410nm-850nm光譜檢測,配備485-685nm或440-790nm白激光,譜線任意可調(diào),滿足染料最佳激發(fā)譜線需求。白激光和HyD檢測器實現(xiàn)激發(fā)和發(fā)射光譜檢測自由。STELLARIS共聚焦平臺使用棱鏡分光和狹縫檢測,在任意波長都可以有非常高的分光效率,利用熒光信號。


        STELLARIS多色成像
         

        NE-115 cells. LifeAct-mNeonGreen (left: yellow, right: red), MitoTracker Green (left: yellow, right: green), NUC Red (left: gray, right: blue), and SiR-tubulin (left: gray, right: magenta)?.Courtesy: Max Heydasch, University of Bern and Spirochrome

        TauSense時間分辨共聚焦成像系統(tǒng)

        NE-115細(xì)胞同時標(biāo)記了actin-mNeonGreen、Mitotracker Green、細(xì)胞核Red和SiR-tubulin共4種熒光染料,但由于LifeAct-mNeonGreen和Mitotracker Green的發(fā)射光譜高度重疊,NuC Red和SiR-tubulin的發(fā)射光譜高度重疊,所以在用常規(guī)共聚焦(左圖)拍攝時只能體現(xiàn)出兩種信號的差異。而在TauSeparation模式下(右圖),基于平均光子到達(dá)時間AAT,我們使用一個檢測器就可以同時將這兩種發(fā)射光譜重疊的染料區(qū)分出來(LifeAct-mNeonGreen-紅色,Mitotracker Green-綠色,Nuc Red–青色,SiR-tubulin–品紅色),所以只需要使用兩個檢測器,就可以得到這幅沒有串色的4色熒光圖像了。

        活體動物、類器官水平

        STELLARIS DIVE光譜式多光子顯微成像系統(tǒng)


        4Tune – the world’s first and only spectral NDD
         

        Blue: Astrocytes, Sulforhodamine;Green: Microglia, GFP;Yellow: Neurons, YFP;Red: Blood, Alexa680-Dextran 活體小鼠在體腦細(xì)胞多色成像

        多光子FLIM在活體細(xì)胞水平研究藥物靶向作用機理

        用FLIM-FRET研究藥物對胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的靶向作用,實現(xiàn)了對腫瘤不同微區(qū)的單細(xì)胞反應(yīng)的觀察。


        Conway JRW, et al. Cell Rep. 2018 Jun 12;23(11):3312-3326. 
          Intravital Imaging to Monitor Therapeutic Response in Moving Hypoxic Regions Resistant to PI3K Pathway Targeting in Pancreatic Cancer

        STELLARIS DLS光片成像

        Leica STELLARIS共聚焦平臺可以無縫升級light sheet功能,升級后一套儀器同時擁有完整的共聚焦和光片的功能。Leica DLS數(shù)字光片技術(shù)可快速實現(xiàn)雙側(cè)照明,具有光毒性低,成像速度快,適合3D成像的優(yōu)點。DLS和雙光子共聚焦搭配,可以實現(xiàn)定點損傷和快速光片成像相結(jié)合。


        Movie courtesy of B. Eismann/C. Conrad at BioQuant/DKFZ Heidelberg 3D培養(yǎng)細(xì)胞光片成像

        細(xì)胞操作
        • Leica DMi8 Infinity Scanner
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        Hela Cells expression paGFP-H2B (histone marker). Courtesy Rebecca Smith, LMU, Munich.

        Leica Infinity Scanner實現(xiàn)快速:
        • 激光切割、消融、解籠鎖、DNA損傷
        • 光激活、光開關(guān)、漂白、光遺傳
        • FRET受體漂白法等光學(xué)刺激實驗


        Leica DMi8 Infinity PLU脈沖激光模塊

        Infinity PLU應(yīng)用:

        • 活細(xì)胞切割
        • 活細(xì)胞和細(xì)胞器消融
        • DNA損傷
         



        MDCK cells, cutting;Sample Courtesy: Prof. Dr. Ralf Jacob, Marburg, Germany

        激光顯微切割精準(zhǔn)取材


        Leica激光顯微切割優(yōu)勢
        1. 正置鏡平臺,適合病理切片和活細(xì)胞樣本切割;
        2. 明場和熒光實時切割,操作簡單快速;
        3. 紫外激光切割,直接汽化,切緣平整不損傷生物大分子;
        4. 激光束移動切割,切割精度可達(dá)0.07μm;
        5. 重力收集,簡單高效,收集耗材成本低,實用高通量切割工具


        單細(xì)胞克隆制備

        THUNDER Imager EM Cryo CLEM冷凍光電聯(lián)用助力細(xì)胞超精細(xì)結(jié)構(gòu)解析

        傳統(tǒng)光電聯(lián)用受限于光鏡分辨率,熒光數(shù)據(jù)在電鏡下目標(biāo)不明確,THUNDER Cryo-CLEM是冷凍光電聯(lián)用專用設(shè)備,具有分辨率高可以精準(zhǔn)識別細(xì)胞結(jié)構(gòu),在相關(guān)工作流程中平穩(wěn)、安全傳送坐標(biāo)、圖像和樣本。


        冷凍光電聯(lián)用實驗流程Cryo-CLEM / Cryo-ET

        徠卡冷凍光電聯(lián)用優(yōu)勢:
        • 冷凍光鏡專用傳輸桿,更換樣品方便
        • 傳輸桿液氮控溫,確保樣品安全轉(zhuǎn)移
        • 有普通載網(wǎng)夾具和Auto grid夾具
        • 該流程中所有附件均由徠卡提供,避免第三方紛爭


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