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        徠卡超薄切片技術(shù)介紹

        更新時(shí)間:2021-03-26      點(diǎn)擊次數(shù):1762

        對樣本開展研究時(shí),為了以納米級分辨率顯示其精細(xì)結(jié)構(gòu),通常會(huì)使用到電子顯微鏡。

        電子顯微鏡有兩種類型:掃描電子顯微鏡(SEM)用于對樣本表面成像,以及需要使用極薄電子透明樣本的透射電子顯微鏡(TEM)。因此,使用電子顯微鏡對樣本內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像時(shí),此類技術(shù)解決方案需要制作出非常薄的樣本切片。被稱為超薄切片技術(shù)的樣本制備方法可以產(chǎn)生具有最小假象的超薄切片(厚度20-150nm)。

        在切片過程中,樣本的塊面(切割切片處)始終保持在一個(gè)平直的表面上,可供SEM進(jìn)行研究。當(dāng)截面在陣列中成像時(shí),就可以重建樣本的三維圖像。這種方法稱為陣列斷層掃描(AT)。超薄切片技術(shù)及其在AT中的應(yīng)用概述如下。

         

        超薄切片技術(shù)

         

        超薄切片技術(shù)主要用作透射電子顯微鏡(TEM)的樣本制備方法。它允許樣本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以納米級分辨率進(jìn)行可視化和分析。它以快速、干凈的方式制作超薄的樣本切片。超薄切片技術(shù)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是切片內(nèi)電子透明區(qū)域的大小和均勻性以及切片產(chǎn)生的速度。

        超薄切片技術(shù)可用于多種類型的樣本,包括生物學(xué)試樣和工業(yè)材料如聚合物(橡膠和塑料)以及韌性、硬質(zhì)或脆性材料(金屬或陶瓷)等。制備這些樣本薄片還有其他技術(shù),如聚焦離子束(FIB)銑削、離子刻蝕、三腳架拋光和電化學(xué)處理,但超薄切片技術(shù)在速度和清潔度方面具有優(yōu)勢。

        陣列斷層掃描 (AT) 是一種用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的高分辨率三維圖像重建方法。該技術(shù)利用掃描電子顯微鏡(SEM)或光學(xué)顯微鏡(LM)中超薄、樹脂包埋連續(xù)切片的有序陣列成像。AT技術(shù)能夠?qū)?xì)胞及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)開展定量立體結(jié)構(gòu)分析和可視化觀察。其橫向和空間分辨率比傳統(tǒng)的共焦顯微鏡更理想。此外,通過生物試樣的部分自動(dòng)化檢測來實(shí)現(xiàn)更高的處理量。

         

        超薄切片原理


        利用陣列斷層掃描進(jìn)行TEM觀察以及實(shí)現(xiàn)優(yōu)化3D重建時(shí),超薄有序的切片是一大前提。超薄切片機(jī)(如徠卡顯微系統(tǒng)的EM UC7)則可以制作出此類超薄的樣本切片(厚度20 ~ 150 nm)。

        要在透射電子顯微鏡中形成樣本的圖像,電子必須在不出現(xiàn)任何重大速度損失的情況下穿透樣本。樣本對電子輻射的滲透率部分取決于其質(zhì)量和厚度(厚度×密度),部分取決于電子顯微鏡的加速電壓。被試樣吸收的電子會(huì)導(dǎo)致熱量積聚,從而在物體中形成假象。

         

        圖1:顯示超薄切片機(jī)樣品臂、刀座和水槽式玻璃刀的側(cè)視圖。

         

        使用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片時(shí),需將樣本插入安裝在特殊軸承上的樣品臂當(dāng)中,由該軸承執(zhí)行垂直切割運(yùn)動(dòng)。切割截面并縮回試樣支臂后,極其準(zhǔn)確的機(jī)電進(jìn)給將試樣稍微向前移動(dòng),移動(dòng)距離與所需截面厚度相對應(yīng)。通過將試樣垂直移動(dòng)到固定玻璃刀或金剛石刀的鋒利刀片上進(jìn)行切片。由于切片過薄,直接從刀片上取下切片很困難。

        因此,它們是在切片程序后從水槽中水面上收集的(或在冷凍切片的情況下借助顯微操作器)。在用電子顯微鏡(EM)檢查之前,可能需要做任何進(jìn)一步的準(zhǔn)備。

         

        陣列斷層掃描的試樣制備

         

        為AT制備生物學(xué)軟試樣時(shí)需要完成若干步驟的操作。這些步驟包括:

        • 組織固定
        • 試樣提取和樹脂包埋
        • 連續(xù)切片和切片帶收集,形成切片陣列
        • 視需要對切片進(jìn)行染色以供成像。

        然后通過SEM或LM(通常為熒光)對切片陣列成像。后續(xù)將陣列中的切片圖像合并在一起進(jìn)行3D圖像重建和分析。

        很多超薄切片機(jī)的AT樣本制備涉及多個(gè)耗時(shí)繁瑣的手動(dòng)操作步驟。高級超薄切片機(jī)(如徠卡顯微系統(tǒng)ARTOS 3D)則可通過試樣切片的自動(dòng)化處理來加速整個(gè)制備過程,最大限度縮短SEM或LM成像中的切片處理時(shí)間。

         

        應(yīng)用圖像

         

        圖2:陣列斷層掃描(ARTOS 3D)高級超薄切片解決方案的金剛石刀頭圖片,可用于執(zhí)行自動(dòng)連續(xù)切片??梢姾穸染鶆虻臒o褶皺條帶漂浮在水槽內(nèi)的水面上。

         

         圖3:黃金的切片表面– AFM圖像

         

        圖4:銅與黃金層的橫截面 – TEM圖像。感謝德國WWU Münster提供的圖片

         

        圖5:通過陣列斷層掃描采集到的小鼠淋巴細(xì)胞的3D圖像重建。感謝奧地利克洛斯特新堡科技研究院(IST)提供的圖片。

         

        圖6:酸硫桿狀菌 HV2/2。感謝馬堡大學(xué)Dr. Andreas Klingl提供的圖片。

         

        圖7:大鼠腎臟。感謝德國漢堡大學(xué)L. Edelmann提供的圖片。

         

        圖8:擬南芥。感謝根特大學(xué)Riet De Rycke提供的圖片。

         

        圖9:擬南芥。感謝根特大學(xué)Riet De Rycke提供的圖片。

         

        圖10:小鼠心臟。感謝根特大學(xué)Riet De Rycke提供的圖片。

         

        圖11:小鼠心臟。感謝根特大學(xué)Riet De Rycke提供的圖片。

         

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